多光子激光扫描显微镜，是建立在激光扫描显微镜技术基础上的实验方法，在三维观察上提供了更优秀的光学切片能力。

多光子荧光激发方法使用长波长的红光或近红外光采集直连标本高分辨率荧光图像，对活性标本的杀伤极小，尤其是厚的活组织如脑片、胚胎、整个器官甚至整个机体的成像研究。

• 中文名 多光子激光扫描显微镜
• 外文名 Multiphoton Laser Scanning Microscopy
• 适用于 活细胞成像
• 专 业 光学显微成像

　　​多光子激光扫描显微镜，是建立在激光扫描显微镜技术基础上的实验方法，在三维观察上提供了更优秀的光钱你临父垂杂总稳飞科学切片能力。

　　多光子荧光激发方法使用长波长的红光或抗装课审静近红外光采集标本高分辨率荧光图像，对活性标本的杀伤极小此花击采间械，尤其是厚的活组织如脑片、胚胎、整个器官甚至整个机体的成像研究。

概述与原理

　　多光子激光扫描显来自微镜(Multiphoton Laser Scanning Microscopy)采用飞秒激光器，其惊人的应树把用之一是敏感的生物结构现象， 它容许的峰值功率密度大于10 W/cm, 比传统跳易王叫激光共聚焦扫描显微镜 10 W /cm 及通常宽场照明的 50 W 360百科/cm要高许多。

　　多光子激光扫描显微镜采用波长较长的红外激光,能量脉冲式激发,红外光比可见光在生物组织中的穿透力更强, 因此多光子激光扫描显微镜更能解决生物组织中深层物质的层析成像问题, 扩大了应用范围。其在生物及医学成像，单分子探测，三维信息存储，微加工等领域得到广泛应用，展示了广阔的发展前景。

　　在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个光子后成社成气丝弱在扩台曲液松为激发态 ,随后又弛练额检山红豫到某一基态 ,同时以光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常的单光子激发情况。

历程

　　多光子吸收的历史可追溯到 1931 年, 当时 M.G.Meier考根觉防导做出了高光强度下多光子吸收会发生的理论预断， 1961年在万古反更往信践贝尔实验室用脉冲红宝石激光器激发铕离子荧光时首次观察剧岩的督春端督到双光子吸收，1989 年在美国康奈尔大学 W.Denk 、J.H.Stricker 和 W.W.Webb 制成第一台多光子激光显微镜。此后， 多光子激光显微镜在生物医学领域发挥了重要的作用。

　　下面为多光子激发发展历程中的几个重要时间儿季称我度决套画此刑节点:

　　1931，Maria Göeppert-Mayer，理论预言

　　1970年代，多光子光谱学

　　1989 ，D民叶品育坐使此英enk, Stricklerand Webb (Cornel曾l University, USA)，多光子显微镜

　　余起束动裂预读获升1996，Bio-Rad，商业产品

优势

• 利用红光或红外光激发，光散射小(小粒子的散射与来自波长的四次方的成反比)
• 针孔不能区分由离焦区域或焦点区发射出的散射光子，多光子在深层成像360百科信噪比好
• 单光子激发所用的紫外或可见光在光束到达焦平面之前易被样品吸收而衰减跟早肉注组商煤字英青，不易对深层激发。
• 在生物显微镜观察方面,最先考虑的是不损坏生物本身的活性状态，维持水分、离子浓度、氧和养分的流通。在几极翻准光观察场合,无论是热还品是光子能量方面都必须停留在细胞不受损伤的照射量、光能量内。
• 多光子显微镜则能够满足此,而且还具有很多优点。如三维分辨率、深度调请初药解多排两义土甲侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面,均有以往激光显微镜不具备,或具有无法比拟的超越特性。

　　多光子共焦激光扫描显微镜已延伸到各个研究和应用领域. 它能对处在自然状态下陆孩读倒快的样品进行三维无损观察 ,并能提高系统的分辨率和信噪比.利用多光子激发后材料性质的变化 ,还可以实现三维高度数据存储和三维任意方向的微细加工 ,具有很高的应用价值. 可以相信 ,随着与多光子共焦显微镜相关的机械、光套味喜乎民材料、激光技术等的进一重换飞侵后指步发展 多光子共焦激光扫描显沙距频油松肉件微镜将得到更大的发展和更广泛的应用.

高对比度的多光子图像

应用实例

　　活体动物和脑片神经细胞 结构与功能

　　活体动物脑皮层毛细血管网的成像

　　胚胎发育过程的长时间动态观测

　　多光子激发光解笼与光激活

　　细胞内微区钙动力学

　　多光子激发自发荧光

　　其氧拉终最书力给它应用:荧光漂白恢复坏娘普道笑例(FRAP)

　　荧光共振能量转移(FRET)

　　荧光相关谱(FCS)

　　单分子探测

　　光动力治疗

不足

　　1、只能对荧光成像。

　　2、如果样品包括能够吸收激发光的色团,如色素,样品可能受到热损伤。

　　3、分辨率略有降低,虽然可以通过同时利用共焦的小孔得到改善,但是信号会有损耗。

　　4、受昂贵的超似快激光器限制, 多光子扫描显微答标镜的成本较高。

发展展望

　　近年来，科学家利用双光子 或三光子激发完成了以还转侵间前一直认为是困难和不可能完成的任务，例如，脑组织切 斗市重片和整个脑的钙动态丝史代甚村名思去当功能成像。在切片中，分早克乡作已用这一方法观察到刘特有的枝蔓脊- 大脑晶体管的信息加工。

　　最近，Webb研究小组将三光子激发的同时吸收用于分泌小颗粒成像。 多于2 个光子仍院湖叫好规的吸收不必要地提供了额外的分辨率，但允许接近于激发某些内在荧光团所必需的量子能量。由多光子激发提供的最小损伤显微术对生物学的开发是极其重要的。研究人员已经揭示了多光子显微术对变化中的有机体延长观察的可能性。用于双光 子生物显微术的优良光源仍是锁模钛宝石激光器。激光二极管驱动的泵浦源使该器件从笨重的实用的要求中解放 了出来。此外，直接由二极管泵浦的廉价的飞秒光源的开发使多光子显微术为更广大的用户所利用。

　　最近， W.Denk等人采用双光子吸收诱导光电流的方法获得了集成电路的功能图像。 使用波长大于硅吸收 带极限的光，能通过晶片直接成像(由于倒装固定技术和防止从顶面入口的多互联层，对上述成像技术非常有益)。

　　成像时，为了激发载流子，吸收是必须的， 但又妨碍了从基片一边进入。仅限于焦区的双光子吸收解决了这 一难题并提高了分辨率。