Southe来自rn印迹法(Southern Blot)360百科是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使D完知音汉元武都NA片段按分子量大小进排列在琼脂糖凝胶上。经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的毛细管作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，经过干燥或紫外线照射处理。单链DNA片段的极性基团与支持膜上影来增承演表门赵的基团结合而使DNA分子牢牢地固定到转移降膜上，转移后的单链DNA分子与32P或35S标记级诉写静丝宁战土的DNA探针按互补原理进行杂交。经放射自显影对特定位置上显服松犯名厂而现的特异DNA片段进行分析。

• 中文名称 DNA印迹法
• 建立时间 1975年
• 创立者 Southern
• 类型 DNA转移的方式
• 器材 电热真空干燥箱 硝酸纤维素滤膜

原理

　　这种方法最初是由Southern于来自1975年建立的。方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特360百科异DNA顺序在电都外临流判饭征使顶夜泳图谱中的位置，也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交。它把电泳便爱伟分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段,而且能进行定位和测定分子量。即先以电泳后照相记录的已知分子量的艺杂海便倍DNA片段(常用Hin台视背杆都黑d Ⅲ 或EcoRⅠ 降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到十树证亲建犯一条标准曲线。然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离,在标准曲线上找出劳受名雷征头金良它管差相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。

器材

　　1电热真空干燥箱 2硝厚一叫件微乡师南呀酸纤维素滤膜或尼龙膜 3大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板 4滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜P参美充具祖色财味刘课载arafilm、一次性手套等 5刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物 二、材料 电泳分离DNA的琼脂糖凝胶

试剂

　　1 酸变性液:0.25mol/L HCl， 用分析纯的来自盐酸12Mol/L稀释 2碱变性液,0.5mol/L NaOH，1.5mol/l NaCl pH13.1 3中和液，0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/车排资坏乱L NaCl 4 20×SSC: 0.3mol/柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录) 5 10×SSC和2×SSC 用双蒸馏水稀释20×SSC储存液

实验步骤

注意

　　注意，操作戴手套。

凝胶处理

　　1)凝胶照相后切去包括标记带在内的多余部分。将凝胶的一角(·点第一个样品的一侧)切去作为标记 以便于定位。精确测量凝胶大小然后将凝胶放入一个方形瓷盘中 。

　　2)变性:将凝胶浸泡于适量的碱变性液中，室温下变性30分钟。期间更换变性液一次，不断地轻轻摇动。如果先进行酸变性酸变性，则凝胶360百科中溴酚兰的颜色由黄变蓝对于较大的DNA片段(·如大于15kb)凝胶可在碱变性前用0.25mol/L HCl预处理10分钟使DNA片段脱嘌呤。凝胶中溴酚兰的颜色由黄变蓝后再进行碱变性。

　　3)中和:移去瓷盘中的碱变性溶液,用双蒸馏水漂洗凝胶两次,然后浸泡于适量的中和液中,室温下轻轻摇动15分钟,更换新鲜中和液,再中和15分钟。

膜处理

　　1)剪下一张与凝胶面积相同的硝酸纤维素膜(NCP)或尼龙膜程己,NL,。注意NCP也要剪去一角且不可用手触摸,粘有油腻的膜不能被湿润,也不能结合什较仅称压DNA。同时剪8,10张与NCP等大的干村践年消净滤纸

　　2)将NCP与3,4张滤纸依次漂浮于盛有双蒸馏水的带盖方盘中,使水自然从NCP的下面向南沉上浸润,待其完全节手茶执状整望信菜浸湿后,连同浸湿的滤纸一起浸入于转移液中浸泡5,10分往级企钟。· 注意,在蒸馏劳水中如NCP表面有气泡时,类企占纸满完布可将其放在65水浴中浸泡几分中,仍有气泡王微及果止者或不能完全被湿润(膜上有白色或黄色斑块)则不张比料展吗增村叶湖剧否能用于转移。

转移

　　1)取一个较大的方形瓷盘,放一块玻璃板于盘上,盘内加转移液(6×SSC或10×SSC)使液面距离玻璃底面约1,2cm,玻璃板表面盖两张预先用转移液浸润乡造育的Whatman 3M ·滤纸(也可用新华滤纸),滤纸两端浸入SSC转移液中,用一玻璃棒将滤纸压平,滤纸与玻璃板间不得有气泡,

　　2)将琼脂糖凝胶翻转(样品孔朝下)后置于上述铺有Whatman 3M·滤纸的平台上,注意:两者之新府识果波少断间不能有气泡。

　　3)用parafilm 蜡膜将凝胶四周平台上裸露的滤纸封严,防止在转移过程中因短路(转移液直接从盘中流向吸水纸而不经过凝胶)使转移效率降低,甚至转易科和影希与发移失败 ,

　　4)将处理好的NCP(已切去一角)小心地覆盖在凝胶上(滤膜的光泽面即标有N.C字样的一面朝向凝胶),NCP的一端与凝胶的上样孔对齐,切按进去的一角与凝胶切角的位置对齐。 注意,滤膜与凝胶之起好际间不能有气泡,且NCP一旦令尽意与凝胶接触即不可再移动,因为阶肥雨求尔常练以划从接触的一刻起,DNA已开始转移,

　　5)将预先用转移液浸润过的与NCP大小相同的Whatman 3M滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上,排出滤纸与膜之间的气泡,

　　6)再放几张相同大小的干滤纸和一叠厚约10,15cm的吸水纸于滤纸上,顶部压一块玻璃板和1kg左右的重物。

　　7)静置12,15小时使其充分转移,其间换吸水纸1,2次。转移液在吸水纸的虹吸作用下从盘中转移到吸水纸上,从而带动DNA从琼脂糖凝胶中转移到NCP上,

　　8)转移结束,移去吸水纸和滤纸,在NCP上用铅笔标上点样孔的位置。·将NCP浸泡在2×SSC中5分钟以去除琼脂糖碎块。将膜放置于一张干燥的新鲜滤纸上,

　　9)在紫外灯下观察凝胶和NCP膜,以了解DNA转移的情况。·在紫外灯下凝胶不显示荧光,NCP膜呈桔红色,并可见到条状的DNA带。

　　10)把NCP置于两层干燥新鲜的滤纸间,真空下80℃烘烤2小时(亦可用其它方法)。此过程可使DNA更加牢固地固定于NCP上。

　　11)此NCP既可直接用于杂交,亦可用塑料薄膜密封,置,20℃冰箱保存备用。

注意事项

　　1,操作时戴手套,严禁用手接触凝胶和硝酸纤维素膜,

　　2,转移时,滤纸与膜、膜与凝胶、凝胶与滤纸桥之间均不能有气泡,否则影响DNA转移,

　　3,凝胶易碎,操作时应格外小心,

　　4,硝酸纤维素膜上的DNA固定非常重要,固定不好时DNA·在杂交过程中会脱落下来,烤膜温度过高,膜脆性增加,易碎,

　　5,大片段DNA转移效率低,可在碱变性前用0.25mol/L HCl浸泡凝胶10,15分钟,使DNA分子脱嘌呤或用短波(260mm)紫外光照射10,20分钟后再行碱变性、转移以提高大片段DNA的转移效率。

　　6,转移液中盐离子浓度对转移有较大影响。10×SSC条件适中,能有效地转移 1,20kb的DNA片段,速度也比20×SSC快,比较常用,6×SSC转移速度最快,·对于高分子量DNA片段(>10kb)的转移较理想,但小分子DNA易丢失。若转移DNA片段较小 ,则宜选用20×SSC。因此应根据不同目的选择适当的转移液。