磷酸钙-DNA 共沉淀法(calcium phosphate-DNA coprecipitation)，简称磷酸沉淀法，能把外源基因与入噬菌体DNA 的重组子导人大肠杆菌和哺乳动物细胞。

磷酸钙沉淀法因为试剂易取得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和CaCl2混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有同房远获志因振克沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。

磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降来自解.

• 中文名称 磷酸钙沉淀法
• 试剂 易取得、价格便宜
• 形成 磷酸钙-DNA共沉淀物
• 表面 DNA黏附

形成原理

　　核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形成出现时，可使DNA黏附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%-5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA来自可以与细胞DNA整合，在细胞中进行师切须月松能稳定表达，基因转导的频率大约为10，这项技术能用于任何DNA导入哺乳动物细胞进行暂时性表达或长期转化的研究。

应用

　　此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液:

　　2× HBS1.63gNaCl;1.19g Hepe360百科s;0.023gNa2PO4.2H2O;加水至100ml(pH7.1)，将换握触企则过滤，<4℃保存。

　　2mmol/L CaCl2过滤除菌。

　　TE 0.1mmol/LEDTA;1mmol/LTris-HCl(pH 绝转下反硫吸8.0).

　　G418(新霉素G418)液1g G418溶于1mmol/L Hepes缓冲液前含因字检视中，加水至10ml，过滤除菌，<4℃保存。

　　G418选择性培养基用含10%胎牛血清的DMEM培养基配制，G418浓度为200-800mg/L。

　　注意对受体细胞先做预实验伟新范效修，选用在10-14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步前步川元抗学握煤子视位骤(方法一):

　　(1)供体DNA制备:按前介绍的DNA提取法提取DNA，溶于TE中，40mg/L。

　　(2)受体细胞的培养:研究癌基因转移燃席功应选择不含人类Al工教亚程造术房将响u序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH-3T3细胞系等，该跳和向已细胞有一定自发转化倾向，一都除尼厚读色文使哥般在转染前1天接种陆固清小细胞，接种密度为2×10个/cm，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5% CO2培养所，待细胞占50%-70%瓶底面积时，用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备:

　　将供体细胞DNA和PSV-2neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时想供体细胞DNA溶液200ul中加入新霉素基因的质粒DNA溶回双范房检规工东慢液(20mg/L)220ul和2 x HBS 250ul(PSV2-neo为1-2mg/L)。

　　取500u皇举亮序落溶史毛半规该l上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml CaCl2(2mol/L)混匀30s。

　　然后立即混旋，室温下静置30min，待溶液轻度浑浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞:

　　将处于对数生长期已占瓶底50%-70%的受体细胞在转染前4h更换一次新鲜培养基，每瓶5ml(25ml培养瓶)。

　　吸取0.5DNA-磷酸钙沉淀，加入含5ml培养基的细胞瓶中摇匀。

　　置37℃、5% CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。

　　更换新鲜培养基，继续培养向难代曾应24h，诱导转染基因的表达水曲导干鲁妈。

　　更换浓度为德晶穿连贵负乱800mg/L的G418选理怀千广翻择培养基进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。

　　培养大约3-5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3-4天更换一次选择培养基。

　　2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行克隆化和扩大培养。可建立转化细胞株，并作进一步鉴定。

　　本实验要加入PSV-neo、DNA于外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的"转化灶"，也可测出转入的外源性基因的抗新霉素的标记。而且还可利用被新霉素基因导入的受体细胞通过G418选择性培养基筛选转化的细胞建立细胞株。Uoyi获取"转化灶"为目的，可不加入PSV2-neo DNA，只需将从癌细胞中提取的基因组DNA导入受体细胞即可，方法如下。

3、基因组DNA转染(方法二):

　　配制磷酸转染。NaCl 8.0g，Hepes5.0g;Na2HPO40.099g;加温水至1000ml。用时现配，pH很重要，一定要控制在6.95±0.65，消毒灭菌，-20℃贮存备用。

　　按前面介绍的方法提取癌细胞基因组DNA。

　　取供体基因DNA50-100ug，加3mmol/L NaCl或醋酸钠，使最终浓度至0.3mmol/L，混匀。

　　再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10min，弃上清。

　　加入转染缓冲液，待DNA充分融解后，夹在如2.5mmol/L CaCl2，终浓度为125mmol/L，用吸管吹打3次，置室温下10-30min，待液体透明度降低，出现微浊蓝色时，即可用于转染细胞。

　　取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞，在转染前4h，更新培养基一次。

　　转染。向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5-1ml，置37℃作用4-6h。

　　培养。弃去培养基，用15%甘油处理3min，无血清培养基漂洗1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2-3周。

　　检测。逐日观察，待出现"转化灶"后，克隆分离，扩大培养建立转化细胞株。