捕捉外显子的载体pETV-SD是一种反转录病毒来自穿梭载体(shuttle vector)，即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母360百科，细菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体。

• 中文名 外显子捕捉
• 外文名 exontrapping
• 类型 动物细胞复制载体

简介

来自　　【exon trapping】

　　是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆云般审目的基因。

外显子捕捉

　　外显子捕捉(exon trapping) 是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆目的基因。捕捉外显子的载体pETV-SD是一种反转录病毒穿梭载体(shuttle vect360百科or)，即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母，因为凡是有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体(splicing donor，SD)位点和剪接受体(细因第婷旧效杨坐存财菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体(见右图)。splicing 她激线修田acceptor，S众价亮A)位点。因此，SA位点可作为基因的标志。pETV-咀载体的克隆位点上游有一个"外显子捕捉序列"(exon trap cassette)，可用来识别载体的插入片段中有无SA位点。它含有β-珠蛋白(HBG)基因的第1个外显子及其有功能的SD位点，该基边密地序火情商革哥较因的间隔序列(IVS)和α，β-半乳糖苷酶(αβ-GAL)基因。

步骤原理

　　操作步骤及其基本原理是:

　　(1)基因组DNA经"霰弹法"切成小片段后，克隆在位于"外显子捕捉序列"下游的克隆位点上。

　　(2)将这些重组载体汇总后感染反转录病毒的专宿包装细胞系(ecotropicretroviral packaging c药策代河本浓承ell line)--ψ2细胞系。ψ2细胞提供蛋白质互帮营顾报的激朝产物使载体(自身不能合成病毒蛋白质)成为反乡面广觉八超套作逐转录病毒在细胞里增殖。当反转录病毒在细胞内转录时，如果插入片段中包含有功能的SA位点，则有可能发生RNA剪接反应而将IVS切除。

　　(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包装在病毒子(virion)中，从细胞培养液中收集后用来感染兼宿反转录病毒包装细胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。这使反转录病毒再进行一轮复制，并产生能感染猴肾细胞系COS细胞的高效价病毒原种。这样做是由于上一轮克隆在病毒中的插入片段的剪接效率极低，而在第二轮复制时则大大提高了RNA剪接的机会。

　　(4)从第二个细胞系PA-317细胞中分离得它督事斤点点金易京到的病毒，用来感染组成型产生SV40T(肿瘤)抗原的COS细胞。病毒RNA基因组被反转录，并在载体上的SV40复制起点作用下，以环状DNA附加体形式进行复制。

　　(5)从COS细胞中回收复制的附加体DNA，经限制性内切酶Dpn I 酶切后转化细菌。在含卡那霉素(Kn)和5-氯-4-溴-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-价六良gal)的培养基上挑选转化子。卢-半乳糖苷酶可水解X-gal而生成蓝色产物。因此，不产生β-半乳糖苷酶的转化子菌落则呈白色。

　　(6)只挑选出白色菌落作进一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二种原因。一是由于基因发生突变机才举谈，使夕-半乳糖苷酶失去活性;二是由于年导引三处己是在反转录病毒生活周期的呢放棉扩举RNA时期中发生了剪接力反应，从而丢失了α,配运何世单伯β-半乳糖苷酶基因。

　　(7)如果是基因突变，赵运笑蒸镇主局善独注则大多数将是缺失了载体中的"外显子捕捉"部分，就可用人的口-珠蛋白基因片段为探针作菌落杂交，很快防原可得到验证。

　　(8)二言此界待湖死要镇如果是真正发生了RNA剪接事件，准确的剪接反应可切除作为标记的IVS，使人口-珠蛋白基因的第1外显子与落入了捕捉陷阱的插入片段中的外显子序列连接，这可直接测定其序列加以证明。

　　从捕捉到的外显子出发，就可进一步用作探针去从基因组基因文库或cDNA文库中分离出基因。