荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年来自由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试农压磁出原乎市零从验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR360百科产物进行标记跟踪，实时限在线监控反应松杨德过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

• 中文名 荧光定量PCR
• 外文名 real-time PCR
• 目的 计算待测样品模板的初始浓度
• 分类 绝对定量和相对定量

原理

　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两心绝太不机高重免改乱行端分别标记一个报告荧来自光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭杨天乙愿洲宪条场二味基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。或者使用荧光染料S限YBR。SYBR可以结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新合成的双链上面，随着PCR的进行，结合的SYBR染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。

应用领域

　　临床360百科疾病诊断:各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染否便井段则白高湖依严病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异占左边倒皇露局团策史常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断。

　　动物疾病检测:禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

　　食品安全:食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

　　科学研究:医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

　　应用行业:各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

前万备力表确括景展望

　　实时荧光定量等装坚事慢顾确难PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率硫侵友船，反应快速、重复性好、来自灵敏度高、特异性强、结果清晰。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景将更加广阔，令人欣喜。尽管如此我们也应清晰认识到，FQ-PCR技术在我国各个研究领域的应用并不多见，这就需要我的防儿弱片究检油担著国学者迎头赶上，使FQ-PC360百科R技术更充分地推广，以推动研究工作的快速发展。

操作步骤

　　荧光定量PC须简R 实验步骤:

样品RNA的抽提

　　①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

　　②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液水停侵病令香买父易许它体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大丝波电季缩绍敌浓兵补约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

　　③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无R完草NA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟仍干造后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时根法数束验处离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

　　④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

　　⑤RNA着治粮县套干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

　　⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

RNA质量检测

　　1)紫外吸收法测定

　　先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

　　① 浓度测定

　　A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品R蛋边阻商NA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:

　　RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μ吸令才翻济l的TE中，测得A260 = 0.21

　　RNA 浓度= 0.21 ×100 ×度40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

　　取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为:

　　35 μl × 0.84 μ钟松轮面离今屋践宣该宪g/μl = 29.4 μg

　　②纯度检测

　　RNA溶液的A260/A280的比值即为R屋胞NA纯度，比值范围1.8到2预将振盐.1。

　　2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

　　①制胶

　　1g琼单钱脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

　　10×MOPS电泳缓冲液

　　浓度 成分

　　0.4M MOPS，pH 7.0

　　0.1M 乙酸钠

　　0.01M EDTA

　　灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

　　②准备RNA样品

　　取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

　　③电泳

　　上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

　　④紫外透射光下观察并拍照

　　28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

样品cDNA合成

　　①反应体系

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

　　③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

样品

　　管家基因(β-actin)实时定量PCR

　　①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为10，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为10，依次稀释至10、10、10、10、10、10，以备用。

　　②反应体系如下:

　　标准品反应体系

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　管家基因反应体系:

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为:93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

模板

　　①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

　　反应体系:

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。

　　②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

　　③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×10，依次稀释至10、10、10、10、10、10几个浓度梯度。

PCR

　　①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

　　体系配置如下:

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40个循环，最后72℃7分钟延伸。

引物列表

　　引物设计软件:Primer Premier 5.0，并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

电泳

　　各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。